左氧氟沙星（ｌｅｖｏｆｌｏｘａｃｉｎ，ＬＶＦ）是氧氟沙星的 左旋異構(gòu)體，由日本第一制藥株式會社于１９８６年開 發(fā)。其抗菌活性約為氧氟沙星的兩倍，主要作用機(jī) 制為抑制細(xì)菌 ＤＮＡ 回旋酶（細(xì)菌拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ）的 活性及抑制 ＲＮＡ 和 蛋 白 質(zhì) 的 合 成，從 而 阻 止 細(xì) 菌 ＤＮＡ 的合成和復(fù)制而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。該 藥 具 有 抗菌譜廣，抗 菌 作 用 強(qiáng) 的 特 點(diǎn)，對包括厭氧菌在內(nèi) 的革蘭陽性菌和革蘭陰性菌具有高度的抗菌活性， 對軍團(tuán)菌、支原體和衣原體也有良好的抗菌作 用。 因左氧氟沙 星 口 服 吸 收 好、生 物 利 用 度 高、組 織 分 布廣且毒副作用小等良好的藥 動 學(xué) （ｐｈａｒｍａｃｏｋｉ－ ｎｅｔｉｃｓ，ＰＫ）特征和藥效動力學(xué)（ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ， ＰＤ）性質(zhì)，已被廣泛應(yīng)用于呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等感染，具有良好的應(yīng)用前景。

１ 材料與方法

１．１ 材料

１．１．１ 藥品與試劑

ＬＶＦ 對 照 品（中 國 食 品 藥 品 檢定 研 究 院，批 號 １３０４５５－２０１１０６，純 度：９７．１％）； 替 硝 唑 （ＴＮＺ，中 國 食 品 藥 品 檢 定 研 究 院，批 號 １００３３６－２００７０３，純度：９９．８％）；肝素（常州千紅生化 制藥股份有限公司，批號 １３０９０４）；ＬＶＦ片（第一三 共制藥有限公司，批號 ＢＭ０４８Ｇ１）；乙腈、甲醇為色 譜純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；磷酸、三乙胺、 磷酸二氫鉀為分析純 （國 藥 集 團(tuán) 化 學(xué) 試 劑 有 限 公 司）。

１．１．２ 儀器

ＨＰ－１１００系列高效液相色譜儀（安 捷倫科技有限公司）；ＴＧＬ－１６Ｇ 型高速離心機(jī)（上 海安亭科學(xué)儀器廠）；ＤＫ－Ｓ２４型電熱恒溫 水 浴 鍋 （上海森信實(shí)驗(yàn)有限公司）；ＷＭ－２Ａ 型無油氣體壓 縮機(jī)（天津 市 醫(yī) 療 器 械 二 廠）；渦旋混合器VORTEX-5(海門市其林貝爾)、超聲波清洗機(jī)（天津奧特塞恩斯有限公司）。

１．１．３ 動物與菌株

ＳＰＦ級Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ） 大鼠，雌 雄 各 半，體 質(zhì) 量 １８０～２２０ｇ，合 格 證 號： ＳＣＸＫ［遼］２０１４－０００１，由中國醫(yī)科大學(xué) 附 屬 盛 京 醫(yī) 院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。 ＰＡ 標(biāo)準(zhǔn)菌株 ＡＴＣＣ２７８５３，由中國醫(yī)科大學(xué)附 屬盛京醫(yī)院檢驗(yàn)科提供。

１．２ 方法

１．２．１ 左氧氟沙星分析方法的建立

（１）溶液的 制 備：精 密 稱 取 ＬＶＦ 對 照 品 １０．００ ｍｇ，置于１０ｍＬ量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度， 搖勻，即得質(zhì)量濃度為１．０００ｍｇ·ｍＬ－１的 ＬＶＦ 儲 備液；精密稱取 ＴＮＺ１０．００ｍｇ，置于５ｍＬ量瓶中， 加甲醇溶解 并 稀 釋 至 刻 度，搖 勻，即得質(zhì)量濃度為 ２．０００ｍｇ·ｍＬ－１的 ＴＮＺ儲備液；精密量取 ＬＶＦ儲 備液，分別稀釋成質(zhì)量濃度為２．０００，５．０００，１０．００， ２０．００，５０．００，１００．０，２００．０μｇ·ｍＬ－１的標(biāo)準(zhǔn)系列溶 液，精密吸取 ＴＮＺ標(biāo)準(zhǔn)儲備液，稀釋成質(zhì)量濃度為 ２００．０μｇ·ｍＬ－１內(nèi)標(biāo)溶液備用。
（２）色譜條件：色譜柱：Ｄｉａｍｏｓｉａｌ－Ｃ１８（１５０ｍｍ× ４．６ｍｍ，５μｍ，北 京 迪 馬 公 司）；流 動 相：０．０５ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸二氫鉀（含三乙胺０．３％，用磷酸調(diào)至ｐＨ３．０ 左右）－乙 腈（８３∶１７）；流 速：１ｍＬ·ｍｉｎ－１；檢 測 波 長： ２９５ｎｍ；柱溫：３０℃。
（３）血 漿 樣 品 處 理 方 法：取 ０．２ ｍＬ 的 血 漿 樣 品，置于１．５ｍＬ 的 ＥＰ管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液１５μＬ （２００μｇ·ｍＬ－１的 ＴＮＺ甲 醇 溶 液），渦 旋 混 勻，加 入 乙腈６００μＬ，渦旋混勻３０ｓ，于１×１０４ ｒ·ｍｉｎ－１高速 離心５ｍｉｎ，吸取上清液，置 于 新 ＥＰ 管 中，５０ ℃恒 溫水浴，上清液以氮?dú)饬鞔蹈伞堅(jiān)尤耄保埃?mu;Ｌ流 動相溶解，于１×１０４ｒ·ｍｉｎ－１離心５ｍｉｎ，取上清液 ２０μＬ進(jìn)行 ＨＰＬＣ分析，并記錄色譜圖。根據(jù)血漿 樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線 方 程，計(jì) 算 血 漿 樣 品 中 ＬＶＦ 的 濃度。
（４）肺泡灌洗液樣品處理方法：取０．２ｍＬ的肺 泡灌 洗 液（ＢＡＬＦ）樣 品，置 于１．５ｍＬ 的 ＥＰ 管 中， 加入內(nèi)標(biāo)溶液１０μＬ（２００μｇ·ｍｉｎ－１的 ＴＮＺ甲醇溶 液），其他同“１．２．１（３）”項(xiàng)下方法，進(jìn)樣體積２０μＬ。 根據(jù) ＢＡＬＦ樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算 ＢＡＬＦ樣品 中 ＬＶＦ的濃度。
（５）肺上皮細(xì)胞襯液藥物濃度的計(jì)算：根 據(jù) ＢＡＬＦ中藥物濃度和尿素氮 濃 度，按照以下公式計(jì) 算肺上皮 襯 液（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｌｉｎｉｎｇｆｌｕｉｄ，ＥＬＦ）中 藥 物 濃度。 ＥＬＦ藥物 濃 度＝ＢＡＬＦ 藥 物 濃 度 × 血 漿 尿 素 氮值／ＢＡＬＦ尿素氮值

１．２．２ ＰＡ 慢性肺部感染大鼠模型的建立

依據(jù)前期摸索的方法建立PＡ慢性肺部感染大鼠模型。

（１）接種菌液制備：從新鮮過夜培養(yǎng)的 ＰＡ 細(xì)菌 平板上挑取完整單菌落置于 ３ ｍＬ 的 ＭＨＢ 肉 湯 中，３７ ℃振蕩過夜，獲得富集 ＰＡ 菌液，于１．２×１０４ ｒ·ｍｉｎ－１，４ ℃離 心５ｍｉｎ，用 生 理 鹽 水 調(diào) 整 密 度 至 ０．５麥（約１．５×１０８ＣＦＵ·ｍＬ－１）。取１ｍＬＰＡ 菌 懸液（１．５×１０８ ＣＦＵ·ｍＬ－１）加入９ｍＬ 藻酸鹽溶液 （１．１％）中，振蕩均勻，用１ｍＬ 注射器 將 混 合 液 緩 慢滴入０．１ｍｏｌ·Ｌ－１ ＣａＣｌ２／Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩沖液中，持 續(xù)攪拌１ｈ，調(diào)節(jié)菌液濃度至０．５麥，冰箱冷藏保存 備用。
（２）菌液接 種：大 鼠 腹 腔 注 射１０％水 合 氯 醛（３ ｍＬ·ｋｇ－１）麻 醉，固 定，經(jīng)口腔氣管插管將配 好 的 ＰＡ 藻酸鹽包被體懸液０．１ｍＬ注入氣管；空白對照 組注入生理鹽水包被體懸液。接種后，大鼠繼續(xù)保 持頭仰立位３０ｓ，并左右旋轉(zhuǎn)體位，以確保菌液均勻 分布于兩肺。大鼠蘇 醒 后，置 于 籠 中 自 由 取 食。大 鼠接種７２ｈ后，每組隨機(jī)選 取４只 大 鼠，以 一 般 狀態(tài)結(jié)合肺勻 漿 涂 板 及 肺 組 織 病 理 學(xué) 檢 查，驗(yàn) 證 ＰＡ 慢性肺部感染大鼠模型的成功率。

２ 結(jié)果

在 已 建 立 的 色 譜 條 件 下，空 白 血 漿、空白血漿加ＬＶＦ對照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液及大鼠 給藥后的血 漿 色 譜 圖 見 圖１。結(jié) 果 顯 示，本 方 法 特 異性高，ＬＶＦ和內(nèi) 標(biāo)（ＴＮＺ）色譜峰峰形良好，保 留 時間分別約為４．２ｍｉｎ和６．３ｍｉｎ，基線平穩(wěn)，大鼠 血漿中的內(nèi) 源 性 物 質(zhì) 不 干 擾 ＬＶＦ 和 內(nèi) 標(biāo) ＴＮＺ 的 測定。取１．５ｍＬ離心管數(shù)支，分 別精密加入不同濃度的 ＬＶＦ 對照品溶液后以氮?dú)?流吹干，加入 空 白 血 漿０．２ ｍＬ，旋 渦 混 勻，配 成 含 ＬＶＦ質(zhì)量濃度分別為０．１００，０．５００，１．０００，２．０００， ５．０００，１０．００，２０．００ μｇ·ｍＬ－１ 的 血 漿 樣 品，按 “１．２．１（３）”項(xiàng) 下 操 作，制 備 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線，并 同 時 制 備 空白樣品進(jìn)行 ＨＰＬＣ－ＵＶ 分析，記錄色譜圖。計(jì)算 血漿樣品中 ＬＶＦ峰面積Ａｓ 和內(nèi)標(biāo) ＴＮＺ峰面積 Ａｉ 的比值ｆ（ｆ＝Ａｓ／Ａｉ），采用最小二乘法以峰面積比 值ｆ對血藥濃度Ｃ 作權(quán)重回歸計(jì)算，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線 方程。　血漿中 ＬＶＦ的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：ｆ＝０．３１６×Ｃ －０．０３１９，ｒ＝０．９９９４。ＢＡＬＦ 中ＬＶＦ的標(biāo)準(zhǔn)曲線 方程為：ｆ＝０．４７５５×Ｃ－０．００１，ｒ＝０．９９９０。結(jié)果 顯示，血漿中ＬＶＦ在０．１００～２０．００ｍｇ·Ｌ－１范圍內(nèi)線 性關(guān)系良好，ＢＡＬＦ中ＬＶＦ在０．０２０～１０．００ｍｇ·Ｌ－１ 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。配制ＬＶＦ低、中、高３個濃度 含藥血 漿 及 含 藥 ＢＡＬＦ 若干份進(jìn)行穩(wěn)定性 考 察。 結(jié)果表明 ＬＶＦ的血漿樣品及 ＢＡＬＦ樣品于４ ℃放 置２４ｈ、反復(fù)凍融３次及－２０℃冰凍１５ｄ的條件下 均穩(wěn)定性良好；血漿樣品及 ＢＡＬＦ樣品經(jīng)前處理后 的上清液在進(jìn)樣器中放置８ｈ穩(wěn)定性良好。

３ 討論

目前，常用的生物樣品中ＬＶＦ分析測定的方法 包括微生物法、ＨＰＬＣ－ＵＶ 法和 ＬＣ－ＭＳ法等。采 用 ＨＰＬＣ－ＵＶ 測定 左 氧 氟 沙 星 的 血 藥 濃 度 具 有 快 速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，可通過選擇合適的固定 相和流動 相 達(dá) 到 最 佳 的 分 離 效 果。本 研 究 建 立 了 ＰＡ 慢性肺部感染大鼠生物樣品中的 ＬＶＦ 濃 度 的 ＨＰＬＣ－ＵＶ 測定方法，選擇０．０５ｍｏｌ·Ｌ－１磷酸二氫 鉀－乙腈（８３∶１７）作 為 流 動 相，并 加 入０．３％三 乙 胺 以改善拖尾問題。因?yàn)椋蹋郑茷閮尚曰衔铮鲃酉嘤昧姿嵴{(diào)至ｐＨ３．０左 右，確 保 ＬＶＦ 不 發(fā) 生 分 解， 在色 譜 圖 中 峰 形 良 好，且 與 內(nèi) 標(biāo) ＴＮＺ 分 離 度 ＞１．５。該方法 回 收 率、準(zhǔn) 確 度、精 密 度、線 性 范 圍 及檢測限均符合生物樣品的要求，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。